蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生什么反應(yīng)
蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑反應(yīng)呈現(xiàn)紫色，這一現(xiàn)象基于肽鍵與堿性銅離子的絡(luò)合作用，常用于生物化學(xué)檢測。反應(yīng)原理涉及蛋白質(zhì)肽鍵在堿性條件下與Cu2?形成紫色絡(luò)合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。
1. 反應(yīng)原理
雙縮脲試劑由氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉和硫酸銅組成。堿性環(huán)境使蛋白質(zhì)肽鍵（-CO-NH-）解離，氮原子孤對電子與Cu2?配位形成四齒螯合物。該絡(luò)合物在540nm波長處有最大吸收峰，紫色深淺直接反映肽鍵數(shù)量。反應(yīng)特異性針對含兩個以上肽鍵的化合物，單氨基酸無此反應(yīng)。
2. 檢測應(yīng)用
臨床生化檢驗常用該方法測定血清總蛋白，正常參考范圍60-80g/L。操作時將試劑與樣本按1:20比例混合，37℃孵育10分鐘后比色。需注意高脂血癥樣本可能產(chǎn)生渾濁干擾，此時可選用雙縮脲-溴甲酚綠聯(lián)合檢測法。實驗室常用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品制作校準(zhǔn)曲線。
3. 干擾因素
血紅蛋白、膽紅素等色素物質(zhì)可能影響比色結(jié)果，需作樣本空白對照。銨離子濃度超過10mmol/L會與銅離子競爭結(jié)合，導(dǎo)致顯色減弱。含EDTA的抗凝血漿會螯合銅離子，應(yīng)避免使用。某些藥物如磺胺類可能產(chǎn)生沉淀，需離心后取上清檢測。
4. 方法優(yōu)化
自動化分析儀采用兩點終點法，在546nm和700nm雙波長檢測消除濁度干擾。微量檢測可使用96孔板模式，樣本量僅需5μL。為提高靈敏度，可添加表面活性劑如Triton X-100增強(qiáng)顯色穩(wěn)定性。實驗室應(yīng)定期驗證試劑線性范圍，通常要求r2≥0.995。
該反應(yīng)是蛋白質(zhì)定量金標(biāo)準(zhǔn)，具有操作簡便、成本低廉的優(yōu)勢。實際應(yīng)用中需結(jié)合樣本類型選擇合適前處理方法，異常結(jié)果應(yīng)結(jié)合電泳或免疫檢測復(fù)核。維護(hù)儀器比色系統(tǒng)的準(zhǔn)確性對保證檢測質(zhì)量至關(guān)重要。
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